Афк в эякуляте повышен мужской фактор. Успехи современного естествознания

Автореферат диссертации по медицине на тему Мужская фертильность и генерация активных форм кислорода в семенной жидкости

г 8 с:-: /I

На правах рукописи

ГРОМЕНКО ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

МУЖСКАЯ ФЕРТИЛЬНОСТЬ И ГЕНЕРАЦИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В СЕМЕННОЙ ЖИДКОСТИ

14.00.16. - патологическая физиология

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2002

Работа выполнена в Центральной научно-исследовательской лаборатории Башкирского государственного медицинского университета и Центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией Республиканской клинической больницы имени Г.Г.Куватова.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор P.P. ФАРХУТДИНОВ

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор М.А.НАРТАЙЛАКОВ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор С.Б.АРТИФЕКСОВ

доктор медицинских наук, профессор Ю.Н.КОВАЛЕВ

Ведущее учреждение:

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Защита диссертации состоится «__» 2002 г. в__часов на

заседании диссертационного совета Д-208.117-02 в Челябинской государственной медицинской академии по адресу: 454092, г.Челябинск, ул.Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

2002 г. Л.В.Кривохижина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последнее время уделяется Зольшое внимание проблемам репродукции, возможности прогнозирования детородной функции у человека. По мнению различных авторов (Тиктинский О,Л., 1999., В.И.Кулаков, Б.В.Леонов, 2000) частота бесплодных браков вставляет 15% - 19%, что отражается на демографических показателях. Примерно в половине случаев бесплодие обусловлено мужским фактором и отмечается дальнейшая тенденция к его увеличению (Felberbraun R., Diedrich ЕС., 1998).

В конце XX начале XXI века во всем мире происходит снижение качества репродуктивного здоровья мужчин (Тер-Аванесов Г.В., Назаренко Т.А., Кулаков В.Й., 2000), Снижение показателей сперматогенеза происходит со скоростью 2% в год при одновременном уменьшении доли подвижных и морфологически полноценных форм сперматозоидов (Auger J. et al., 1995., Irvine S. et al., 1996., Sharpe R.M. et al., 1995). Сперматогенез представляет собой процесс непрерывного деления клеток, наиболее уязвимых для патогенного воздействия неблагоприятных химических, физических и бытовых агентов. Явление снижения сперматогенной функции, по всей вероятности, служит отражением возрастающего воздействия на организм человека повреждающих факторов, встречающихся в окружающей среде, на производстве и бьпу (Быков В.Л., 2000). Выяснение механизмов, повлекших за собой бесплодие, в каждом конкретном случае важно для выбора оптимальной тактики лечения.

Общепринятым для оценки мужской фертильности является изучение параметров эякулята, куда входят макроскопические, микроскопические, биохимические и функциональные критерии. Оценка показателей спермограммы в значительной степени субъективна и зависит от характеристик исследуемого образца: чем выше концентрация сперматозоидов в эякуляте и чем меньше доля прогрессивно подвижных форм, тем менее согласуются результаты разных лаборантов. В ряде случаев низкая частота оплодотворения в культуре является следствием функциональных аномалий сперматозоидов, не выявляемых при анализе традиционных показателей спермограммы (Леонтьева О.А., Воробьева О.В., Козлов В,В., 2000). С другой стороны, стандартные методы диагностики не всегда позволяют судить о причинах изменения функций сперматозоидов (Руководство ВОЗ, 1999). Таким образом, результаты рутинных исследований эякулята недостаточно надежны с клинической точки зрения, так как в ряде случаев фертильность бывает не нарушена при значительных отклонениях спермограммы от нормы, в то время как бесплодие может наблюдаться у мужчин с нормозооспермией (Liu D., Baker H.W.G., 1992).

В последнее время появляются публикации, свидетельствующие о влиянии свободно-радикального окисления (СРО) на процессы репродукции (Conte G., Milandi D., De Marinis L., 1999). В частности, доказана способность сперматозоидов к образованию свободных радикалов (CP), получивших

обобщающее название - активные формы кислорода (АФК): супероксидный анион-радикал, анион-радикал гидроксила, синглентная форма кислорода, перекись водорода и гипохлорит. Проблема действия активных форм кислорода на сперматозоиды в настоящее время мало изучена. Ясно лишь, что избыток активных форм кислорода может оказать негативное влияние на половые клетки (Аккея ВЛ., 1999).

В последнее время для выявления АФК начинают использовать хемилюминесцентные методы с применением специальных индукторов свечения. В качестве индукторов, не влияющих непосредственно на ход процесса, а лишь увеличивающих интенсивность регистрируемой хемилюминесценции (люминофоров), используются люминол, люцигенин, аналоги люциферина. Другой тип индукторов ускоряет процессы свободно-радикального окисления, В частности, к ним относятся ионы металлов переменной валентности, например, соли двухвалентного железа, перекись водорода, перманганат калия, щелочи.

В этой связи теоретический и практический интерес представляют исследования, посвященные выявлению механизмов нарушений репродуктивной функции мужчин, разработке экспресс-методов оценки генерации активных форм кислорода в сперме и определению состояния свободно-радикального окисления в эякуляте.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить состояние свободно-радикального окисления в семенной жидкости при мужском бесплодии.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить состояние генерации активных форм кислорода в эякуляте в норме и патологии.

2. Определить уровень суммарной антиокислительной активности спермоплазмьг.

3. Выбрать оптимальные условия определения состояния свободно-радикальиого окисления и антиокислитедьной активности в сперме, основанные на регистрации хемилюминесценции.

4. Клинически обосновать эффективность применения хемшиоминесцентных методов исследования как дополнительного критерия оценки мужской фертильности.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенных исследований разработан экспресс-метод оценки состояния свободно-радикального окисления в эякуляте, заключающийся в определении интегральных показателей суммарной антиокислительной активности спермоплазмы в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода, и спонтанного люминолзависимого свечения эякулята.

Уточнены механизмы, приводящие к некоторым формам мужского бесплодия. При мужской инфертильности происходит увеличение генерации

активных форм кислорода функционально неполноценными сперматозоидами при высокой антиокислнтельной активности спермоплазмы.

Определена патогенетическая роль нарушения процессов генерации активных форм кислорода при мужской инфертштьности. Показано, что при идиопатических формах мужского бесплодия происходит повышение генерации активных форм кислорода.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложен, апробирован и внедрен в практическую деятельность врачей-урологов неинвазивный экслресс-метод регистрации хемилюминесценции эякулята для изучения состояния генерации активных форм кислорода и антиокислительной активности спермоплазмы при мужском бесплодии.

С помощью разработанного метода установлены нормативные показатели хемилюминесценции при обследовании мужчин с доказанной фертильностью. В норме эякулят характеризуется низким уровнем свечения и высокой антиокислительной активностью спермоплазмы.

Намечены новые подходы к патогенетическому лечению мужского бесплодия с учетом роли свободно-радикального окисления, заключающиеся в проведении рациональной антиоксидантной терапии, коррекции генерации активных форм кислорода.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ВНЕДРЕНИЕ ЕЁ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ

Материалы диссертации доложены на:

1. Научно-практическом семинаре Российской ассоциации репродукции человека «Лечение бесплодия: нерешенные проблемы», Саратов, 2001г.;

2. Заседании общества урологов Республики Башкортостан, 2000г. и

3. Секционном заседании «Репродуктивное здоровье мужского населения РБ» съезда врачей акушеров-гинекологов и педиатров Республики Башкортостан, г.Уфа, 2001г.;

4. Республиканской молодежной научной конференции «Вопросы теоретической и практической медицины», г.Уфа, 2001г.;

5. I Международном Конгрессе «Новые медицинские технологии», г. Санкт-Петербург, 2001г.;

6. Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека», г. Смоленск, 2001г.

7. Семинаре акушеров-гинекологов «Современный взгляд на вагинальные инфекции. Хламидиоз. Кандидоз. Вопросы мужского бесплодия», г.Уфа, 2002г.

Разработанный метод регистрации активных форм кислорода в эякуляте используется для диагностики и определения тактики лечения

мужского бесплодия в Республиканском Центре планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией г.Уфы. Материалы, полученные в диссертации, введены в учебную программу и включены в курс лекций для студентов Башкирского государственного медицинского университета, а также курсантов института последипломного образования Башкирского государственного медицинского университета.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Разработан метод оценки генерации активных форм кислорода в эякуляте и определения антиокислительной активности спермоплазмы, основанный на регистрации хемилюминееценции.

2. Усиление генерации активных форм кислорода в сперме выявлено при некоторых формах мужского бесплодия,

3. При исследовании свободно-радикального окисления в эякуляте выделена разновидность «патоспермии» при идиопатическом бесплодии, определить которую стандартными методами исследования эякулята не представляется возможным.

4. Выявление патогенетических механизмов, связанных с нарушением генерации активных форм кислорода в сперме и приведших к мужскому бесплодию, позволяют обосновать соответствующую тактику лечения, направленную на нормализацию свободно-радикального окисления в эякуляте.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Работа изложена на 116 страницах машинописного текста, состоит да разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Практические рекомендации», «Указатель литературы». Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 13 рисунками. В библиографический указатель включено 205 источников литературы, из которых 88 - отечественные и 117 - зарубежные.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе, в соответствии с поставленной целью и задачами, были выделены следующие основные этапы исследования (таблица 1). Было предварительно обследовано 160 мужчин, обратившихся в Республиканский Центр планирования семьи и репродукции с медико-генетической консультацией на базе Республиканской клинической больницы им. Г.Г.Куватова. Из них 10 человек - это мужчины с доказанной фертильностью (доноры спермы). Остальные 150 мужчин обратились по поводу бесплодия в браке. Из этого числа обследованных были исключены пациенты с азооспермией, генетическими аномалиями, острыми воспалительными процессами специфической и неспецифической этиологии (орхоэпидидимиты, простатиты, везикулиты, уретриты), с доказанными иммунологическими

факторами инфертильности, а также мужчины старше 40 лет. В группу наблюдения не вошли также мужчины, фертильность супруг которых была сомнительной (трубное бесплодие, нарушения менструального цикла, эндометриоз, лоликистоз яичников и т.д.).

В результате направленного отбора выделена группа соматически здоровых сексуально активных мужчин (41 пациент), которая явилась объектом углубленного клинико-лабораторного обследования. в настоящей работе. Основную группу составил 31 пациент с мужским фактором бесплодия, контрольную группу составили 10 пациентов с доказанной фертильностью (доноров спермы).

Таблица 1

Общая характеристика проведенного исследования _

№ Этапы и задачи исследования Объект и объем исследования Вид исследования

1 Определение показателей нормы ХЛ семенной жидкости и ее компонентов 10 здоровых доноров Исследование яюминолзависимой (ЛЗХЛ) и Ре2" индуцированной ХЛ семенной жидкости и ее компонентов.

2 Клинико-лабораторное обследование бесплодных мужчин, исследование ХЛ семенной жидкости и ее компонентов. 31 пациент, состоящий в бесплодном браке; 10 здоровых доноров Объективное обследование; общеклиническое, стандартный лабораторный анализ семенной жидкости. Регистрация люминолзависимой (ЛЗХЛ), Ге2+индуцированной ХЛ семенной жидкости, клеток и спермоплазмы.

3 Анализ результатов сравнения, выбор наиболее информативных показателей для оценки фертильносги 31 пациент, состоящий в бесплодном браке; 10 здоровых доноров Статистическая обработка данных с использованием 1-критерия Стьюдента, сравнение показателей ХЛ семенной жидкости с традиционными клинико-лабораторными данными.

Было проведено определение показателей нормы ХЛ семенной жидкости и её компонентов путем обследования мужчин контрольной группы. Далее выполнено клинико-лабораторное обследование, исследование ХЛ спермы и её компонентов мужчин основной группы. После статистической обработки полученных результатов, анализа полученных данных проведен

выбор наиболее информативных показателей, характеризующих функциональное состояние спермы.

Всем" пациентам проведено комплексное клинико-лабораторное обследование с применением инфекционного скрининга (путем полимеразной цепной реакции), гормональных методов диагностики (определение фолликулостимулирующего гормона, тестостерона, пролактина), трансректального ультразвукового исследования предстательной железы и семенных пузырьков, доплерографии сосудов мошонки. Проводилось исследование сока предстательной железы. Донорам спермы и пациентам с олигозооспермией выполнено кариотипирование с целью исключения генетической патологии. Всем пациентам проводились общеклинические исследования эякулята, включающие двукратную оценку семенной жидкости, полученную с интервалом 14 дней. В обеих группах регистрировали ЛЗХЛ и Fe2 "-индуцированную ХЛ цельной спермы и её компонентов. Разделение клеток семенной жидкости проводили методом изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности,

Регистрацию люминолзависимой хемнлюминесценции (ЛЗХЛ) и Fe2*-индуцированной ХЛ эякулята проводили на аппарате «Хемилюминомер - 003» с компьютерным обеспечением, изготовлешшм в Межвузовской лаборатории технических систем медико-биологических исследований. Об интенсивности ЛЗХЛ судили по ряду параметров, в первую очередь, по светосумме (СС) и максимальной амплитуде свечения (МсС), которые соответствовали скорости образования АФК. Перед измерением свечения определенный исследуемый объем спермы смешивали с 2 мл физиологического раствора, содержащего люашмол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазинднон) в конечной концентрации 105 М, и помещали в светоизолированную камеру прибора. Тщательно перемешивали и вели запись ХЛ при 37 °С в течение 5 мин.

Для оценки антиокислительной активности 0,1 мл спермоплазмы добавляли к модельной системе (МС). В качестве модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера (КН2РО4- 20 rtiM, КС1 - 105 шМ, рН доводили до 7,45 титрованием насыщенным раствором КОН) с цитратом (50 гпМ) и люминолом (10"? М). В течение 10 секунд записывали темповой ток, после чего вносили инициатор образования АФК - 1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа (FeS0471120). Конечная концентрация FeS04 в среде инкубации составляла 2,5 тМ, Запись свечения проводили в течение 5 минут при постоянном перемешивании. При оценке Ре2+-индуцированной ХЛ определяли величину спонтанного свечения (СпС), продолжительности латентного периода от момента введения ионов железа до начала развития медленной вспышки. Также оценивали амплитуды быстрой и медленной вспышек.

С целью определения источника АФК в эякуляте проводили разделение клеток спермы в градиенте плотности путем изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности. В качестве градиента использовали фиколл/гипак: 20мл 9% фиколла ■+■ 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл. рН

приготовленного градиента доводилась до 7.5. Раствор фиколла обладает незначительным осмотическим давлением во избежании повреждения разделяемых клеток. Для разделения клеток 1мл эякулята наслаивали на 1мл приготовленного градиента и центрифугировали при 500 g в течение 20 минут. Убирали надосадок, оставляя 0,2 мл центрифугата, который встряхивали и измеряли концентрацию сперматозоидов. Также проводили окраску полученных мазков с целью определения полиморфноядерных лейкоцитов. Для исследования концентрацию сперматозоидов доводили до исходной величины, то есть до уровня концентрации в нативном эякуляте, путем разведения известного объема осадка физиологическим раствором. В последующем вели регистрацию ЛЗХЛ. При использовании данной методики нейтрофилы оседали с частотой 94-95%.

Статистическая обработка полученных данных проводилась по группам мужчин методами, принятыми стандартной статистикой с использованием ПЭВМ Pentium II-200. В каждой клинической группе для оценки определенных показателей составляли вариационные ряды с последующей их обработкой: расчетом показателей структуры (в %), определением средней арифметической (М), квадратического отклонения (б), ошибки репрезентативности средней или относительной величины (т). Оценка достоверности результатов проводилась с применением критерия Стьюдента (t).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Средний возраст мужчин с доказанной фертильностью (контрольная группа) составил 28,7±0,8 лет, мужчин, обследованных по поводу бесплодия (основная группа) - 29,3±0,7 лет.

Мужчины основной группы состояли в бесплодном браке от 1 года до 13 лет (45,2% обследованных свыше 2,5 лет), В анамнезе у них наиболее часто встречались хронический простатит, заболевания, передающиеся половым путем, варикозное расширение вен семенного канатика. 10 (32,3%) мужчин имели факторы производственной вредности.

Мужчины контрольной группы не имели в анамнезе вышеперечисленных заболеваний, состояли в браке, имели здоровое потомство (1-3 ребенка). Сперма этих мужчин использовалась для донорской инсеминации.

Показатели спермограмм мужчин контрольной группы соответствовали нормативным требованиям.

По результатам анализа спермограмм у мужчин с бесплодием нами в основной группе были выделены следующие подгруппы:

Нормозооспермия - (показатели соответствуют нормативным значениям) - 17 человек (54,8%);

Олигозооспермия - (снижение концентрации сперматозоидов ниже 20 млн/мл) - В человек (25,8%);

Астенозооспермия - (снижение подвижности сперматозоидов категории А-В менее 50%) - 6 человек (19,4%);

Тератозооспермия - (увеличение доли патологических форм

сперматозоидов более 40%) - определялась у 5 (16,1%) человек. Изолированно тератозооспермия не выявлялась, а сочеталась с олигозооспермией в двух случаях (6,5%) и астенозооспермией в трех случаях (9,7%).

Эти данные представлены графически на рисунках 1 и 2.

Рис. 1 Структура результатов спермограммы пациентов основной

В нормозооспермия

Ш астенозооспермия

тератозооспермия 16.1%

□ астенозооспермия

□ олигозооспермия

Рис. 2 Структура патоспермии в основной группе

Сравнительные характеристики эякулята основной и контрольной групп представлены в таблице 2. Выявлено достоверное отличие по содержанию клеток сперматогенеза в обследуемых группах: 4,7±0,7 млн/мл в

основной группе и 2±0,6 млн/мл в контрольной группе. Также выявлены достоверное уменьшение числа сперматозоидов категории «А» и увеличение числа сперматозоидов категории «О» в основной группе, по сравнению с контрольной. В обеих группах число лейкоцитов не превышало 1х 106/ мл. Достоверных отличий по содержанию лейкоцитов в анализируемых группах не выявлено.

Таблица 2

Показатели спермограммы в основной и контрольной группах

Показатели спермограммы основная группа (п-31) контрольная группа (п-1Р)

Концентрация сперматозоидов, млн/мл 54,9±8,1 81,2+11,2

Подвижность сперматозоидов, %: категории «А» 43,4±2,8*** 57,6±2,0

Морфологически полноценные, формы % 67,1+1,7 71,2+1,3

Объем, мл 3,3±0,2 3,1±0,2

Клетки сперматогенеза, млн/мл 4,7±0,7** 2+0,6

Примечание: ** -р<0,03; ***- р<0,001.

Для разработки оптимальной тактики ХЛ исследования семенной жидкости было валено выяснить, как влияют на показатели свечения изменение объема и длительность хранения исследуемого материала. Значимым моментом исследования является определение основного источника АФК в эякуляте. С этой целью на первом этапе проводили разделение эякулята на спермоплазму и клетки, в дальнейшем для отделения полиморфноядерных лейкоцитов Осуществляли изопикнотическое центрифугирование в градиенте плотности. Отдельно проводилась оценка суммарной аитиокислительной активности (АО А) спермонлазмы, степень которой оценивалась по способности подавлять свечение модельной системы.

Влияние изменения объема и длительности хранения эякулята на уровень ЛЗХЛ.

С целью выработки нормативных показателей ЛЗХЛ семенной жидкости были обследованы пациенты контрольной группы. Для регистрации ЛЗХЛ исследуемый материал забирался в следующих объемах: 0,05; 0,1 и 0,3 мл. По мере увеличения объема исследуемого материала шел рост основных параметров ХЛ. Ввиду невозможности получения большого количества материала и необходимости его использования для других анализов решено

ограничиться объемом исследуемого образца равным 0,1мл. С целью исключения изменений ЛЗХЛ в процессе хранения проведена оценка ХЛ в контрольной группе. Запись ЛЗХЛ вели через 15; 30; 45; 60 мин. Характер ХЛ спермы не меняется в течение 60 минут. Следовательно, в течение часа от момента сбора эякулята, при соблюдении правил сбора, транспортировки, хранения можно проводить измерение ХЛ эякулята.

Определение источника АФК в эякуляте.

Возможными источниками АФК в эякуляте могут являться сперматозоиды и круглые клетки. В качестве материала для исследования использовали 0,1мл взвеси клеток и 0,1 мл спермоплазмы, полученные после центрифугирования 1 мл эякулята при 500g в течение 20 минут. Каждый образец помещали в физиологический раствор люминола в конечной концентрации 10"5 М, вели запись по разработанному протоколу. Полученные данные представлены в таблице 3. На основе полученных данных можно сделать вывод, что источником АФК в эякуляте являются клетки. Уровень показателей светосуммы и максимальной светимости достоверно отличаются от соответствующих показателей полученных при исследовании спермоплазмы.

Таблица 3

Уровень ЛЗХЛ клеток и спермоплазмы в контрольной группе........... >=10)........

Показатели ЛЗХЛ Диапазон значений Среднее значение М±т Уровень достоверности отличий

клетки плазма клетки плазма

светосумма, отн.ед. 4.2918.75 0.351,73 8.6±2.8 0.9±03 р< 0,05

спонтанная светимость, отн.ед. 0.172.11 0.062.62 1.0*0.5 0.5±0.5 -

максимальная светимость, отн.ед. 1.125.41 0.160.57 2.4±0.8 0.4±0.1 р< 0,05

Для определения уровня генерации АФК различными клетками семенной жидкости 1 мл эякулята подвергали изопикнотическому центрифугированию в градиенте плотности. При использовании данной методики нейтрофилы оседали с частотой 94-95%. Результаты исследования эякулята в контрольной группе представлены в таблице 4.

Таблица 4

Уровень ЛЗХЛ нативной спермы и отмытых сперматозоидов в контрольной группе (п~10)

Показатели ЛЗХЛ Нативная сперма Отмытые сперматозоиды Уровень достоверности отличий

светосумма, отн.ед. 2,9±0,8 2,8±0,4

спонтанная светимость, отн.ед. 0,9±0,27 1Л±0,07 -

максимальная светимость, отн.ед. 0,7+0,17 0,6±0,1 -

Таким образом, можно сделать вывод о том, что примесь лейкоцитов в эякуляте здоровых доноров достоверно не влияет на суммарный уровень ХЛ семенной жидкости.

Для определения роли лейкоцитов в генерации АФК проведено обследование 5 пациентов с лейкоспермией, которые не вошли ни в основную, ни в контрольную группы. Уровень лейкоцитов у этих мужчин превышал 1x106, и составил в среднем 2,5±0,ЗхЮ"5. Обследование проводилось по вышеуказанной методике. Полученные результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Уровень ЛЗХЛ нативной спермы и отмытых сперматозоидов у ___пациентов с лейкоспермией _________

Показатели ЛЗХЛ Лейкоспермия Нативная сперма в контр, группе

Нативная сперма Отмытые сперматозоиды

светосумма, отн.ед. 30,2±6,5* 4,4±1,2 2,9±0,8

спонтанная светимость, отн.ед. 7,1±1>3* 1,23±0,7 0,9±0,3

максимальная светимость, отн.ед. 9,3±2,1* 2,6±0,8** 0,7±0,2

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с отмытыми сперматозоидами;

**- р<0,05 в сравнении с контрольной группой. Получены

достоверные различия по всем показателям ЛЗХЛ после выделения отмытых сперматозоидов у пациентов с лейкоспермией. Сравнивая уровни показателей ЛЗХЛ нативной спермы в контрольной группе и уровни показателей ЛЗХЛ отмытых сперматозоидов у пациентов с лейкоспермией, достоверные различия получили по уровню МсС. Уровни СС и СпС достоверно не различались. Так как источником АФК в эякуляте являются сперматозоиды и лейкоциты, то в случаях лейкоспермии у пациентов методика ЛЗХЛ спер мы может быть выполнена после разделения клеток методом изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности.

Определение антиокислительной активности спермоплазмы.

Интегральной величиной антиоксидантного потенциала семенной

плазмы является способность спермоплазмы угнетать свечение модельной системы, в которой протекают реакции СРО.

Антиокислительные свойства спермоплазмы оценивали в % от величины угнетения свечения МС, при добавлении к последней 0,1мл спермоплазмы. Расчет проводили по формуле:

SAOA= 100% - (SMC - SMCCIT)/ SMCrl00%, где SAOA - суммарная антиокислигельная активность; SMC - светосумма модельной системы; SMCCI1 - светосумма модельной системы + спермоплазма. Суммарная АО А спермоплазмы доноров составила в среднем 41,9 %. Суммарная АОА спермоплазмы пациентов основной группы составила в среднем 41,6%.

На рисунке 3 представлен алгоритм проведения экспресс-метода регистрации ХЛ эякулята.

Рис. 3. Алгоритм определения АФК и АОА эякулята.

Изучение процессов генерации АФК спермы в норме было выполнено у 10 пациентов контрольной группы (здоровых доноров спермы). В дальнейших исследованиях использовались полученные результаты в качестве нормативов для сравнения с показателями ЛЗХЛ и Ре2 индуцированной ХЛ мужчин, состоящих в бесплодном браке. Изучение процессов генерации АФК спермы при патологии было выполнено у 31 пациента основной группы (мужчин с бесплодием).

В таблице 6 представлены основные показатели ЛЗХЛ в основной и контрольной группах до и после разделения клеток. Выявлены достоверные различия между уровнями ХЛ основной и контрольной групп. Повышение параметров СС в основной группе, вероятно, связано с различной способностью лейкоцитов генерировать АФК, а также с патоспермией, выявляемой у пациентов основной группы. Для исключения роли лейкоцитов в генерации АФК проведен сравнительный анализ после разделения клеток в градиенте плотности. В результате показатели ЛЗХЛ в основной группе после отмывания оказались значительно ниже, чем в нативной сперме, но достоверность различий с контрольной группой сохранялась.

Таблица 6

Основные показатели ЛЗХЛ в наблюдаемых группах

Основные показатели ЛЗХЛ Основная группа (п-31) Контрольная группа (п*10)

напшная г сперма 1 Сяетосумма свечения,отн.ед 28,9±8,5** 2.9±0,8

Спонтанное свечение,отаед 4,8±1,5* 0,9А0,3

Максимальная светимость,отн.ед 6,7±1,9** 0,7±0,2

отмытые сперматозоид Свстосумма свечения,отн.ед 12,1±1,9*** 2,8±0,4

Спонтанное свечение,отн.ед 2,5±0,5** 1,1±0Д

Максимальная светимость,отн.ед 4,1±0,8*** 0,6±0,)

Примечание: *- р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001.

На следующем этапе исследования сопоставляли морфо-функциональные параметры эякулята пациентов основной группы со способностью к генерации АФК сперматозоидами. В таблице 7 представлены сводные данные по всем подгруппам основной группы до и после разделения клеток, а также аналогичные данные обследования контрольной группы.

Морфо-функцноналъные показатели и показатели ХЛ основной и контрольной групп

Таблица 7

Тератоэоспермия (п-5) Нормозооспермия (п=17) Одигозооспермия (п=8) Астаюзоспермда (п=6) Основная группа (0=31) контрольная группа <п=10)

отмыт, клетки натив. сперма отмыт, клетки iMTHB. сперма отмыт, клепаг натив. сперма ОТМЫТ. клетки наша, сперма ошьгг. клетки натии. сперма ОТМЫТ. клегги натив. сперма

Кол-во- клеток млн/мл - 27,6±6,5 - 71,4+ 13,5 - П.Ш.8 - 50,5+7,1* - 54,9± 8,1 - 81,2±IU

а - 2S,4±4,4 **+ - 54,6+2,2 - 41,9±4,5 - 21,3±4,6 - 43,4± 2,8*** - 57,612,0

1 Ь - 19+5,7 - 14,8±1,б 16,1+2,8 - 14+1,4 - 15±1,1 - I2,t±2,4

"s с - 7Д±3,1 4,8±1,1 - 7,3£2,9 16,714,9* - 6,9±1,6 3,Ш,6

D - 48,4±7,8* - 25,8±2.1 - 34,7±1,6 - 4816,6** - 34,71 1,9** - 27,2+1,3

Морфология % - 47,4±1,8 - 73,1 ±0,9 - 62,9±4,2 - 60,2±5,4 - 67,111, 7 - 71,211,3

Кол-во лейкоцитов 0 менее Ылв"мд 0 менее 1мяа"мл 0 менее 1 млн/мл 0 менее 1 млнмл 0 менее 1млн/м 0 менее 1мли"юг

а о СС 23,3± 3,90"** 39,3+11,3 12,9± 2,8** 38,3± 14,9* 8,2±3,2 13,4 ±6,8 15.3+ 53* 22,9±Ш,9 12,1+ 1 д*** 28,9± 8,5** 2,8±0,4 2,9+0,8

§ 3 2 s СпС 3,03±0.6 3,910,7** 3,3±0,8 ** 7,1±2,7* 1,4+0,4 1.Ш.7 1,810,7 2,110,7 2,510,5 4,8+1,5 * 1,1+0,1 0,910,3

Ы s MC 8,242,6* 9,9+3,1** 4,5+1,2 »* 8,7±3,4* 2,6+1,3 3,4±1,9 5,02± 2,5 5,612,8 4,110,8 6,7+1,9 ** 0,6±0,1 0,7±0,2

S а СС - 29,3±1.8 - ЗЗ.Ш.0 - 30,1 ±3,2 - 32,Э±2,1 - 31,7± 1,1 - Э1,9±1,9

т Ш СпС - 7,4+1,3 - 7,5+1,9 - 8,9±!,6 - 8,0±},8 - 8,8±] - б,9±1,2

Ьз Я £ а а.? Мс - 13,9±0,9 - 15ДЮ.8 - 14,8+0,6 - 15,6+0,7 14,8± 0,3 - 15,Ш,0

Из таблицы видно, что в целом морфо-функциональные параметры эякулята основной группы достоверно отличались от контрольной лишь по подвижности: по категории «А» (быстрое поступательное движение сперматозоидов) - р<0,001, и по категории «В» (неподвижные сперматозоиды) - р<0,01. Различия при анализе морфо-функциональных характеристик в подгруппах соответствовали принципу, по которому было проведено разделение на данные подгруппы. Так, в подгруппе с олигозооспермией достоверные различия по сравнению с контрольной группой были выявлены по количеству клеток (р<0,001) и по подвижности (по категориям «А» и «О» - р<0,01), при этом концентрация сперматозоидов была ниже нормативных показателей ВОЗ, а процент подвижных сперматозоидов соответствовал нормам ВОЗ. В подгруппе с астенозооспермией достоверные различия по сравнению с контрольной группой были выявлены по уровню подвижности (категории «А» - р<0,001, категории «С» - р<0,05, категории «О» - р<0,01) и по количеству клеток - р<0,05, хотя в среднем концентрация сперматозоидов в этой подгруппе соответствовала нормам ВОЗ, В подгруппе с нормозооспермией достоверных различий по сравнению с контрольной группой не было.

В подгруппе с тератозооспермней достоверные различия выявлены, в отличие от остальных подгрупп, по морфологическим параметрам (р<0,001), а также по показателям прогрессивно подвижных сперматозоидов (р<0,001), концентрации половых клеток (р<0,01).

При анализе показателей ЛЗХЛ нативной спермы пациентов основной группы выявлены достоверные отличия по уровню СС (р<0,01), СпС (р<0,05), Мс (р<0,01) в сравнении с контрольной группой. Различия сохранились и после разделения клеток в градиенте плотности; СС (р<0,003), СпС (р<0,01), Мс (р<0,001). Однако, не во всех подгруппах основной группы были получены аналогичные результаты, достоверные различия выявлены при нормозооспермии и тератозооспермии. Основные показатели ЛЗХЛ при тератозооспермии достоверно отличались от соответствующих показателей контрольной группы (СС - р<0,01, СпС - р<0,01, Мс - р<0,01). Различия сохранились и после разделения клеток в градиенте плотности: СС (р<0,001), СпС (р<0,01), Мс (р<0,05). Видимо, увеличение показателей ЛЗХЛ обусловлено большей способностью сперматозоидов с измененной морфологией к генерации АФК.

При исследовании нативной спермы пациентов с олигозооспермией и астенозооспермией по сравнению с контрольной группой достоверных различий не выявлено. В то же время после разделения клеток показатели СС в подгруппе с астенозооспермией стали достоверно отличаться от контрольной группы (р<0,05). На увеличение среднего показателя светосуммы повлияло наличие в данной подгруппе пациентов с тератозооспермией. Как уже было указано выше, изолированно тератозооспермия не выявлялась, а сочеталась с олигозооспермией в 6,5% случаев и астенозооспермией в 9,7%случаев.

При сравнении показателей ЛЗХЛ у пациентов основной группы с нормозооспермией и пациентов контрольной группы были получены достоверные различия по уровню СС (р<0,05), СпС (р<0,05), Мс (р<0,05). Различия увеличились после разделения клеток в градиенте плотности: СС (р<0,01), СпС (р<0,01), Мс (р<0,01). Таким образом, у пациентов основной группы с нормозооспермией не было выявлено достоверных отличий с контрольной группой по основным морфо-функциональным характеристикам эякулята, но обнаружены достоверные отличия по показателям ЛЗХЛ.

На основании этого можно сделать вывод, что имеется разновидность «патоепермии» при бесплодии, установить которую стандартными методами исследования эякулята не представляется возможным. При проведении анализа была выявлена большая способность к генерации АФК сперматозоидов с неполноценной морфологической структурой, что изолированно не определялось, а сочеталось с другими видами патоепермии. Это является доказательством того, что АФК на этапе созревания половых клеток могут служить непосредственной причиной патоепермии. Этап дозревания сперматозоидов проходит на уровне придатка яичка. Наибольшее число пациентов с патоспермией имели различные нарушения на уровне эпидидимиса с одной или двух сторон, следовательно, действие патологических факторов именно на уровне придатка яичка приводит к формированию патологических форм сперматозоидов, которые в последующем оказывают повреждающее действие на более полноценные формы. Это проявляется в виде увеличения содержания неподвижных форм сперматозоидов в эякулятах с высоким уровнем СРО.

В исследовании показана способность спермоплазмы угнетать свечение модельной системы. Данный феномен ингибирующего влияния биологической жидкости на генерацию АФК можно объяснить наличием в ней антиоксидантов, угнетающих образование радикалов на различных фазах цепной реакции СРО. Спермоплазма пациентов основной и контрольной групп в одинаковой степени влияла на показатели СС и Мс модельной системы. Таким образом, нарушение процессов свободно-радикального окисления в эякуляте связано с повышенной генерацией АФК клетками (морфологически и функционально аномальные сперматозоиды и лейкоциты), при этом суммарная антиокислительная активность остается стабильной в отсутствии поражения добавочных половых желез.

Изучение фракций семенной жидкости в процессах СРО, выявление их участия в ХЛ представляло интерес для уточнения причин, ведущих к нарушению состояния СРО при некоторых нозологиях, оцененных по нормативам ВОЗ. Обнаружено увеличение основных показателей ЛЗХЛ как осадка, так и цельного эякулята у инфертильных мужчин по сравнению с контрольной группой. Не выявлено достоверных различий при исследовании суммарной АОА семенной плазмы в указанных группах. По данным литературы, процент объемных компонентов эякулята, образующийся в яичках, составляет в среднем 5%. Основная масса эякулята формируется на

уровне добавочных половых желез (предстательная железа, семенные пузырьки, Куперовы железы) и представлена в основном жидкой частью эякулята (спермоплазма). Спермоплазма формирует основную массу АО потенциала семенной жидкости. Можно предположить, что АОА спермоплазмы не влияет на формирование половых клеток, так как образование основного объема спермоплазмы происходит на уровне добавочных половых желез. Незрелые сперматозоиды с повышенной способностью к генерации АФК могут оказывать свое повреждающее действие на полноценные половые клетки до того момента, как последние смешаются с основным объемом спермоплазмы, являющейся основным источником антиоксидантов в эякуляте. Учитывая то, что различий между основной и контрольной группой по уровню суммарной АОА не было выявлено, а уровень определяемых показателей хемилюминесценцин (СС, СпС, Мс) достоверно различался, можно заключить, что АФК играют роль в патогенезе мужского бесплодия и применение антиоксидантных препаратов клинически оправдано. С целью дифференцированного подхода к антиоксидантной терапии мужского бесплодия целесообразно предварительно определять состояние свободно-радикального статуса. При наличии дисбаланса процессов окисления необходимо проводить коррекцию генерации АФК в зависимости от локализации поражения, действуя либо на уровне придатков яичек, либо на уровне добавочных половых желез.

Таким образом, на основе обобщения данных литературы и результатов собственных исследований можно прийти к выводу, что АФК играют важную роль в патогенезе мужского бесплодия. Разработан эффективный экспресс-метод определения АФК в сперме, основанный на регистрации ХЛ. Проведена оценка уровня антиокислительной активности в спермоплазме. Клинически обоснована эффективность применения хемилюминесцентных методов исследования как дополнительного критерия оценки мужского фертильности. Намечены патогенетические механизмы к лечению некоторых видов мужского бесплодия антиоксидантами.

1. Разработан и апробирован в клинических условиях комплексный подход для выявления мужской инфертильности, основанный на оценке состояния свободно-радикального окисления в эякуляте путем определения генерации активных форм кислорода в сперме и антиокислительной активности в спермоплазме.

2. Выбраны оптимальные условия для измерения активных форм кислорода методом регистрации люминолзависимой хемилюминесценции эякулята и определения антиокислительной активности спермоплазмы в модельной системе, генерирующей активные формы кислорода,

3. В норме сперматозоиды характеризуются низкой способностью к генерации активных форм кислорода, а спермоплазма обладает высокой антиокислительной активностью.

4. При патологии (мужской инфертильности) происходит увеличение интенсивности свободно-радикального окисления в эякуляте за счет повышенной генерации активных форм кислорода функционально неполноценными сперматозоидами на фоне неизмененной антиокислительной активности спермоплазмы при отсутствии воспаления в урогенитальной зоне.

5. Метод регистрации спонтанного люминолзависимого свечения эякулята и определения общей антиокислительной активности спермоплазмы является эффективным дополнительным критерием при оценке мужской инфертильности, наряду с традиционными клинико-лабораторными методами исследования.

1. Разработанный комплексный метод хемилюминесцентного исследования процессов генерации активных форм кислорода в эякуляте и определения общей антиокислительной активности спермоплазмы рекомендуется применять для оценки мужской инфертильности в клинической урологии, как эффективный дополнительный метод диагностики.

Перед измерением свечения 0,1 мл исследуемой спермы следует смешать с 2 мл физиологического раствора, содержащего люмииол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) в конечной концентрации 10-5 М, тщательно перемешать и вести запись хемилюминесценцин при 37 °С в течение 5 мин;

Исследование может быть проведено в течение 1 часа после разжижения;

При величине светосуммы, превышающей 2,9±0.8 спн.ед., даже при нормативном" содержании лейкоцитов, необходимо проведение разделения клеток путем изопикнотического центрифугирования в градиенте плотности с

последующим определением уровня люминолзависимой

хемилюминесценции;

В качестве градиента плотности используется фиколл/гипак: 20мл 9% фиколла + 10,0 мл 50% гипака; плотность 1,12 г/мл. рН приготовленного градиента доводится до 7.5. Для разделения клеток 1мл эякулята наслаивается на 1мл приготовленного градиента и центрифугируется при 500 g в течение 20 минут.

В качестве модельной системы используется 20 мл фосфатного буфера (КН2Р04 - 20 mM, КС1 - 105 тМ) с цитратом (50 тМ) и люминолом (10-5 М). В течение 10 секунд длится запись темнового тока, после чего вносится инициатор XJI - 1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа (FeS047H20). Запись свечения проводится в течение 5 минут;

Спермоплазму, полученную после центрифугирования семенной жидкости, в объеме 0,1 мл следует добавить к модельной системе. В течение 10 секунд длится запись темнового тока, после чего вносится инициатор XJI -1 мл 50 шМ раствора сернокислого железа. Конечная концентрат« сернокислого железа в среде инкубации составляет 2,5 тМ, Запись свечения проводится в течение 5 минут при постоянном перемешивании;

Антиокислительные свойства спермоплазмы оцениваются в процентах от величины угнетения свечения МС, при добавлении к последней спермоплазмы по формуле:

S АОА= 100% - (SMC - SMCCn)/ SMC г 100%,

где SAOA - суммарная антиокислительная активность;

SMC - светосумма модельной системы;

SMCCn - светосумма модельной системы + спермоплазма.

4. Применение антиоксидантных препаратов при терапии мужской инфертильности целесообразно при повышении генерации активных форм кислорода в эякуляте, сопровождающемся увеличением интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции сперматозоидов, или уменьшении суммарной антиокислительной активности спермоплазмы, оценивающейся по угнетению свечения модельной системы.

1. Методы оценки репродуктивной функции мужчин. - Уфа: Здравоохранение Башкортостана, 2001. - 48с. (соавт.: Р.Р.Фархутдинов, Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеева, А.П.Голощапова, Н.Й.Симонова,

B.И.Иваха)

2. Метод регистрации хемилюминесценции для оценки мужской фертильности// Новые медицинские технологии: Материалы 1-го Международного конгресса. - СПб., 2001. - С.62. (соавт.: Р.Р.Фархутдинов, Р.Р.Садыков)

3. Репродуктивное здоровье мужчин как индикатор экологического неблагополучия"/ Лечение бесплодия: нерешенные проблемы: Сборню научных трудов. - Саратов, 2001. - С.15-16, (соавт.: Ш.Н.Галимов Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеева, В.И.Иваха)

4. Влияние активных форм кислорода на мужскую фертильность.// Вопрось теоретической и практической медицины: Материалы 66-й Республиканец научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ. - Уфа, 2001, -

5. Свободнорадикальное окисление в патогенезе мужского бесплодия/. Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека: Материалы научно практической конференции с международным участием. - Смоленск, 2001. -С.176-177. (соавт.: Р.Р.Фархутдинов, Р.Р.Садыков)

6. Активные формы кислорода в эякуляте// Здравоохранение Башкортостана -2001. - Спец. выпуск Х»5.: Неотложные состояния в урологии. - С.92. (соавт. Р.Р.Садыков Р.Р.Фархутдинов, М..А. Нартайлаков)

7. Оценка репродуктивного здоровья мужчин-рабочих одного из предприятий г Туймазы// Здравоохранение Башкортостана. - 2001. - Спец. выпуск №8. ■ С.28-32. (соавт.: А.В,Варшавский, Э.Ф.Аглетдинов, М.И.Павлов, А.А.Ракчаев

8. Оценка риска репродуктивному здоровью мужчин в Республик Башкортостан// Проблемы интеграции науки, образования и производств южного региона Республики Башкортостан: Сборник научных трудов Peer научно-практической конф. - Уфа: Кзд-во «Тилем», 2001. - С. 13-16. (соавт. Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеева, А.П Голощапош И.И.Симонова, А.Р.Мавзютов, В.И.Иваха)

9. Антропогенное загрязнение среды обитания и репродуктивное здоровь мужчины// Химическая экология: Материалы школы-семинара. - Уфа, 2001. С. 163-166. (соавт.: Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов)

10. Анализ риска репродуктивному здоровью мужчин в экологическ неблагополучном регионе: критерии оценки.//Научные аспект] экологических проблем России: Тез. докл. Всероссийской конф. - СПб., 200 -С. 140. (соавт/. Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов,Н.И.Симонов; Х.Г.Валеева,. П.Голощапов, В.И.Иваха)

11, Синдром андрогенной недостаточности как маркер техногенног загрязнения среды обитання//Проблемы репродукции, - 2002. -Т.8, №1, С.46-50. (соавт.: Ш.Н.Галимов, Ф.Х.Камилов, Э.Ф.Аглетдинов, Х.Г.Валеев А,П.Голощапов, В.И.Иваха).

2
1 ФГБУ «Поликлиника No 1» УДП РФ, Москва; НУЗ «Дорожная клиническая больница им Н.А. Семашко», Москва; ГБОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ; ФГАОУ ВО «РУДН», Москва
2 НУЗ «Дорожная клиническая больница им Н.А. Семашко», Москва
3 НУЗ «Дорожная клиническая больница им Н.А. Семашко», Москва; ГБОУ ВО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» МЗ РФ

Мужской фактор имеет место в половине случаев бесплодного брака. В настоящее время принято считать, что наиболее частой причиной мужского бесплодия − 35−40% случаев − являются идиопатическая олиго-, астено- или тератозооспермия, когда нарушения в количественных и качественных показателях спермы наблюдаются при отсутствии анамнестических факторов риска, отсутствии нарушений в результатах медицинского осмотра и гормональных исследований. Антиоксиданты – популярные препараты для лечения мужского бесплодия. Однако данные об их эффективности противоречивы.
Цель исследования: показать возможности отечественного биологически активного комплекса АндроДоз® для лечения идиопатического мужского бесплодия.
Материал и методы: в исследовании участвовали 30 мужчин из бесплодных пар в возрасте 25−45 лет. Исследование эякулята проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ. Определяли содержание активных форм кислорода в нативном эякуляте и отмытых сперматозоидах. Повреждение хромосом сперматозоидов характеризовали по фрагментации ДНК, оцениваемой методом дисперсии хроматина в агарозном геле. Анализ эякулята проводили до и во время лечения препаратом АндроДоз® перорально по 4 капсулы в сутки (по 2 утром и вечером).
Результаты: через 1,5 мес. лечения у 2/3 пациентов наблюдалось уменьшение процента и степени фрагментации ДНК в среднем на 5 и 10% соответственно (р<0,01); уменьшилась выраженность оксидативного стресса в 70% случаев в среднем по группе более чем в 2 раза (p<0,05). Показатели стандартной спермограммы при этом не менялись.
Выводы: препарат АндроДоз® может применяться при лечении идиопатического мужского бесплодия с признаками оксидативного стресса и нарушениями целостности ДНК сперматозоидов; на данную терапию позитивными изменениями качества спермы реагируют около 2/3 пациентов.

Ключевые слова: мужское бесплодие, оксидативный стресс, фрагментация ДНК, антиоксиданты.

Для цитирования: Божедомов В.А., Липатова Н.А., Божедомова Г.Е., Щербакова Е.В., Комарина Р.А. Применение комплекса нутриентов для лечения мужского бесплодия // РМЖ. 2016. №23. С. 1546-1552

Food additive for male infertility
Bozhedomov V.A. 1−4 , Lipatova N.A. 2 , Bozhedomova G.E. 2,3, Shcherbakova E.V. 2 , Komarina R.A. 2

1 Outpatient Department No. 1 of the Department for Presidential Affairs, Moscow
2 N.A. Semashko Road Clinical Hospital, Moscow
3 .M. Sechenov First Moscow State Medical University
4 Peoples" Friendship University of Russia, Moscow

Half of the barren marriage cases accounts for male infertility. The most common causes (35−40%) of male infertility are idiopathic oligospermia, asthenospermia, and/or teratospermia. In these cases, abnormal sperm quantity and quality are not associated with anamnestic risk factors, abnormal medical examinations or hormonal imbalances. Antioxidants are popular agents for male infertility, however, their efficacy is controversial.
Aim. To analyze the efficacy of domestic bioactive additive AndroDoz® for idiopathic male infertility.
Patients and methods. 30 men from infertile couples aged 25−45 were enrolled. Ejaculate was examined according to WHO recommendations (including ROS measurement in native ejaculate and washed spermatozoa). Chromosomal aberrations in spermatozoa were assessed by DNA fragmentation evaluated with sperm chromatin dispersion test. Ejaculate was tested before and in the course of the treatment (oral AndroDoz® 2 capsules twice a day).
Results. After 1.5 months, the percentage and the degree of DNA fragmentation reduced by 5% and 10%, respectively, in two-third of the patients (p<0.01). The severity of oxidative stress decreased more than twice in 70% of the patients (p<0.05). Standard spermogram parameters remained unchanged.
Conclusions. AndroDoz® can be recommended for idiopathic male infertility with oxidative stress and altered DNA integrity of spermatozoa. Two-third of the patients respond to this treatment demonstrating sperm quality improvement.

Key words: male infertility, oxidative stress, DNA fragmentation, antioxidants.

For citation: Bozhedomov V.A., Lipatova N.A., Bozhedomova G.E. et al. Food additive for male infertility // RMJ. 2016. № 23. P.1546 –1552.

В статье рассматривается применение комплекса нутриентов для лечения мужского бесплодия

Введение

Материал и методы

Результаты

Через 1,5 мес. лечения наблюдалось значимое уменьшение повреждения ДНК сперматозоидов (табл. 2; рис. 2). Процент сперматозоидов с фрагментацией ДНК в абсолютных значениях снижался в среднем по группе на 4%, медиана – на 5% (относительно исходного уровня −23% для средней, p<0,01 и −28% для медианы, р=0,01); меньше стала степень выраженности таких нарушений, оцениваемых по степени дисперсии хроматина (−10% для средней, p<0,05 и −12% для медианы, p<0,01). Положительная динамика фрагментации ДНК на фоне лечения имела место у 67% мужчин (p>0,05).

На фоне лечения статистически значимо уменьшилась выраженность ОС, о чем свидетельствовало уменьшение продукции АФК отмытыми сперматозоидами в 70% случаев (табл. 3; p<0,05) в среднем по группе более чем в 2 раза; изменения медианы были еще более наглядны – −82% (рис. 3; p<0,05). При этом продукция АФК в нативном эякуляте изменялась статистически несущественно и даже имела тенденцию к повышению (см. табл. 3; p>0,05).

Обсуждение

Выводы

Литература

1. WHO Manual for the Standardized Investigation, Diagnosis and Management of the Infertile Male. Cambridge: Cambridge University Press, 2000; 91.
2. Andrology: Male Reproductive Health and Disfunction. 3rd. E.Nieschlag., H.M. Behre, S. Nieschlag (Ed.), 2010; 629.
3. Male infertility / S.J. Parekattil, A. Agarwal (Ed.), 2012, Springer; 518.
4. Jungwirth A. (Ed.), Diemer T., Dohle G.R. et al. Guidelines on Male Infertility. © European Association of Urology. 2016; 42.
5. Сухих Г.Т., Божедомов В.А. Мужское бесплодие. Практическое руководство для урологов и гинекологов, М.: Эксмо, 2009. 240 с.: ил. Медицинская практика .
6. Божедомов В.А. Мужской фактор бездетного брака – пути решения проблемы. Урология. 2016. № 1 (Приложение 1). С. 28–34 .
7. Mirone V. (Ed.). Clinical Uro-Andrology. Springer; 2015. P. 197–205.
8. Hughes E.G., Grantmyre J., Zini A. An integrated approach to male-factor subfertility: bridging the gap between fertility specialists trained in urology and gynaecology // J Obstet Gynaecol Can. 2015 Mar. Vol. 37(3). P. 258–265.
9. Jae Hung Jung, Ju Tae Seo. Empirical medical therapy in idiopathic male infertility: Promise or panacea? // Clin Exp Reprod Med. 2014. Vol. 41(3). P. 108–114.
10. Singh A., Jahan N., Radhakrishnan G. et al. To Evaluate the Efficacy of Combination Antioxidant Therapy on Oxidative Stress Parameters in Seminal Plasma in the Male Infertility // J Clin Diagn Res. 2016. Vol. 10(7). P. 14–17.
11. Garolla A., Ghezzi M., Cosci I. et al. FSH treatment in infertile males candidate to assisted reproduction improved sperm DNA fragmentation and pregnancy rate. Endocrine. 2016 Jul 27. .
12. Simoni M., Santi D., Negri L. et al. Treatment with human, recombinant FSH improves sperm DNA fragmentation in idiopathic infertile men depending on the FSH receptor polymorphism p.N680S: a pharmacogenetic study // Hum Reprod. 2016 Sep. Vol. 31(9). P. 1960–1969.
13. Божедомов В.А., Торопцева М.В. Ушакова И.В. и соавт. Активные формы кислорода и репродуктивная функция мужчин: фундаментальные и клинические аспекты (обзор литературы) // Андрология и генитальная хирургия. 2011. №. 3. С. 26–33 .
14. Zini A., Fischer M.A., Nam R.K. et al. Use of alternative and hormonal therapies in male infertility. Urology 2004. Vol. 63. P. 141–143.
15. Tremellen K. Oxidative stress and male infertility – a clinical perspective. Hum.Reprod.Update. 2008. Vol. 14(3). P. 243–258.
16. Agarwal A., Sekhon L.H. Oxidative stress and antioxidants for idiopathic oligoasthenoteratospermia: Is it justified? // Indian J Urol 2011. Vol. 27. P. 74.
17. Sabeti P., Pourmasumi S., Rahiminia T. et al. Etiologies of sperm oxidative stress. Int J Reprod BioMed 2016. Vol. 14. P. 231–240.
18. Akmal M., Qadri J.Q., Al-Waili N.S. et al. Improvement in human semen quality after oral supplementation of vitamin C // J Med Food. 2006 Fall. Vol. 9(3). P. 440–442.
19. Ross C., Morriss A., Khairy M. et al. A systematic review of the effect of oral antioxidants on male infertility // Reprod Biomed Online. 2010. Vol. 20(6). P. 711–123.
20. Zini A., Al-Hathal N. Antioxidant therapy in male infertility: fact or fiction? // Asian J Androl. 2011. Vol. 13(3). P. 374–381.
21. Showell M.G., Mackenzie-Proctor R., Brown J. et al. Antioxidants for male subfertility. Cochrane Database Syst Rev. 2014. (12):CD007411. doi: 10.1002/14651858.CD007411.pub3. Epub 2014 Dec 15.
22. WHO (2010) WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen, 5th edn. WHO, Geneva.
23. Agarwal A., Deepinder F. Determination of seminal oxidants (reactive oxygen species) // Infertility in the Male, 4th edn (eds L.I. Lipshults, S.S. Howards & C.S. Niederberger), 2009. P. 618–632.
24. Gosalvez J., Lopez-Fernandez C., Fernandez J.L.Sperm chromatindispersion test: technical aspects and clinical applications // Sperm Chromatin. Biological and Clinical Applications in MaleInfertility and Assisted Reproduction. Zini A., Agarwal A. (Eds.), Springer. 2011. P. 151–170.
25. Камалов А.А., Абоян И.А., Ситдыкова М.Э. и соавт. Применение биологически активного комплекса Андродоз® у пациентов с патоспермией и иммунолгическим фактором инфертильности. Результаты мультицентрового клинического исследования // Фарматека. 2014. № 4. С. 29–40 .
26. Алчинбаев М.К., Медеубеков У.Ш., Хусаинов Т.Э. и соавт. Новые подходы к лечению патоспермии // Урология. 2013. № 2. С. 46–49 .
27. Дендеберов Е.С., Виноградов И.В. Опыт применения биокомплекса АндроДоз для фертилизации больных с идиопатической патоспермией // Эффективная фармакотерапия. № 2014. Т. 47 (Урология и нефрология № 4). С. 2–3 .
28. Проскурин А.А., Голубкин Е.А., Поливин П.А., Казарян Э.Э. Сравнительная оценка эффективности комплексной терапии идиопатического бесплодия // Проблемы репродукции. 2013. № 6. С. 65– 66 .
29. Неймарк А.И., Клепикова И.И., Неймарк Б.А. и соавт. Применение препарата АндроДоз у мужчин с нарушением фертильности // Андрология и генитальная хирургия. 2013. № 4. С. 44–52 .
30. Aitken J.R., De Iuliis G.N. Role of oxidative stress in the etiology of sperm DNA damage // Sperm chromatin: biological and clinical application in male infertility and assisted reproduction / A.Zini, A.Agarwal (Ed.). 2011. Springer. Р. 277–294.
31. Agarwal A., Durairajanayagam D., du Plessis D.S. Utility of antioxidants during assisted reproductive techniques: an evidence based review // Reproductive Biology and Endocrinology 2014. Vol. 12. P. 112.
32. Yao D.F., Mills J.N. Male infertility: lifestyle factors and holistic, complementary, and alternative therapies // Asian Journal of Andrology. 2016. Vol. 18. P. 410–418.
33. Scott R., MacPherson A., Yates R.W., Hussain B., Dixon J. The effect of oral selenium supplementation on human sperm motility // Br J Urol. 1998. Vol. 82. P. 76–80.
34. Keskes-Ammar L., Feki-Chakroun N., Rebai T., Sahnoun Z., Ghozzi H., Hammami S. et al. Sperm oxidative stress and the effect of an oral vitamin E and selenium supplement on semen quality in infertile men // Syst Biol Reprod Med. 2003. Vol. 49. P. 83–94.
35. Omu A., Al-Azemi M., Kehinde E., Anim J., Oriowo M., Mathew T. Indications of the mechanisms involved in improved sperm parameters by zinc therapy // Med Princ Pract. 2008. Vol. 17. P. 108–116.
36. Galatioto G.P., Gravina G.L., Angelozzi G. et al. May antioxidant therapy improve sperm parameters of men with persistent oligospermia after retrograde embolization for varicocele? // World Journal of Urology. 2008. Vol. 26. P. 97–102.
37. Lombardo F., Sansone A., Romanelli F. et al. The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility: an overview // Asian Journal of Andrology. 2011. Vol. 13. P. 690–697.
38. Menezo Y.J., Hazout A., Panteix G., Robert F., Rollet J., Cohen-Bacrie P., Chapuis F., Clement P., Benkhalifa M. Antioxidants to reduce sperm DNA fragmentation: an unexpected adverse effect .// Reprod Biomed Online 2007. Vol. 14. P. 418– 421.
39. Absalan F., Ghannadi A. Value of sperm chromatin dispersion test in couples with unexplained recurrent abortion. J Assist Reprod Genet. 2012. Vol. 29. P. 11–14.
40. Gharagozloo P., Aitken R.J. The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy // Hum Reprod. 2011. Vol. 26(7). P. 1628–1640.
41. Lombardo F., Sansone A., Romanelli F., Paoli D., Gandini L., Lenzi A. The role of antioxidant therapy in the treatment of male infertility: an overview // Asian J Androl. 2011. Vol. 13. P. 690–737.
42. Giustarini D., Dalle-Donne I., Colombo R., Milzani A., Rossi R. Is ascorbate able to reduce disulfide bridges? // A cautionary note. Nitric Oxide 2008. Vol. 19. P. 252–258.
43. Menezo Y., Evenson D., Cohen M., Dale B. Effect of antioxidants on sperm genetic damage // Adv Exp Med Biol. 2014. Vol. 791. P. 173– 89. doi: 10.1007/978-1-4614-7783-9_11. Review. PubMed PMID: 23955679.

Андрологическая лаборатория

Спермограмма по ВОЗ 2010 1607 p.

Антиспермальные антитела на сперматозоидах (Мар тест непрямой Ig G) 1928 p.

Антиспермальные антитела на сперматозоидах (Мар тест непрямой Ig A) 1928 p.

Антиспермальные антитела на сперматозоидах (Мар тест прямой Ig G) 1499 p.

Антиспермальные антитела на сперматозоидах (Мар тест прямой Ig A) 1499 p.

Посткоитальный тест (тест in vivo) 2142 p.

Тест Курцрока Миллера 2142 p.

Лаборатория клинической андрологии выполняет специальные анализы для мужчин

Все мальчики перед армией в школе проходят медицинский осмотр. Это помогает выявить различные нарушения, в том числе связанные с репродуктивным здоровьем. Редко, когда молодой мужчина в дальнейшем по собственной инициативе обращается к врачу для профилактики. В основном, приходят на обследование, когда уже есть жалобы, либо по инициативе партнерши, либо в законном браке, когда несколько лет не получается зачать ребенка.

Во всех этих случаях, как для профилактики, так и при наличии различных проблем, наша задача – объективно оценить ситуацию, правильно выбрать перечень необходимых анализов, провести исследования и отправить результаты на электронную почту пациента. В дальнейшем пациент при необходимости может обсудить данные этих анализов с врачами урологом-андрологом, или гинекологом-репродуктологом, которые работают в нашей поликлинике.

Основное направление работы лаборатории клинической андрологии – это мужское бесплодие и сочетанные формы мужского и женского бесплодия, а также инфекционно-воспалительные процессы мочеполовой системы мужчины.

Сотрудники лаборатории - врачи, медицинские технологи, лаборанты, - работают вместе уже 6 лет, являются ведущими специалистами по сперматологии в нашей стране. У многих опыт работы в Научном центре акушерства и гинекологии им. В.И.Кулакова, клинике урологии им. Р.М.Фронштейна Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, клиники андрологии Российского университета дружбы народов. Лабораторные исследования, выполненные нашими сотрудниками, лежат в основе многих научных работ по андрологии, диссертаций и публикаций, в т.ч. в ведущих англоязычных журналах.

Квалификация, необходимое оснащение и многолетний опыт работы позволяет выполнять различные исследования спермы на экспертном уровне.

Анализы выполняются точно по всем требованиям ВОЗ-2010 года.

Внедрены в клиническую практику самые современные методы оценки функции сперматозоидов: оксидативного стресса, акросомной реакции, фрагментации ДНК, нарушений упаковки хроматина и др.

Все анализы выполняются здесь же в лаборатории, никуда не отвозятся, сразу, как только материал разжижается.

Имеются прекрасные условия для сдачи спермы: отдельная звукоизолированная комната с туалетом и раковиной, большой телевизор. Помещение для сдачи спермы находится непосредственно рядом с лабораторией.

Исследование эякулята (спермы) – основные требования

Исследование спермы - концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, содержание лейкоцитов, антиспермальных антител, повреждений ДНК, многих других функциональных показателей, - основной метод оценки мужской фертильности.

Несмотря на внедрение компьютерных технологий, исследование спермы, выполненное опытным врачом-лаборантом, по-прежнему самый точный, надежный и воспроизводимый способ диагностики.

Проводить исследование спермы следует в специализированных лабораториях, а не лабораториях общего профиля (тем более не в сетевых лабораториях), поскольку описание большинства параметров спермограммы – подвижность, морфология, МАР-тест и др., - субъективная и в решающей степени зависит от опыта и квалификации врача-лаборанта. В идеале анализ спермы в динамике должен проводить один специалист, поскольку даже при строгом внутреннем контроле качества в лаборатории, расхождения в результатах при выполнении анализа разными врачами могут иметь место.

Сперма – материал непростой. Повышенная вязкость, неполноценная сдача, наличие лейкоцитов, незрелых клеток сперматогенеза, бактерий, различные категории подвижности может правильно определить только врач с большим опытом работы. За последнее время несколько раз менялись нормы ВОЗ по исследованию спермы, и в разных лабораториях стоят разные референсные значения. Так же надо учитывать сезонные колебания показателей спермограммы, состояние пациента на данный момент, его психологические особенности.

Сперму для анализа следует сдавать при половом воздержании от 2 до 7 суток, желательно ближе к привычному ритму сексуальной активности. Исключить алкоголь, не болеть, не париться, не принимать горячую ванну, быть здоровым.

При отклонении показателей спермограммы при первичном обследовании от нормальных, анализ следует повторить через 2-6 нед для подтверждения диагноза. Поскольку сперматогенез – процесс образования зрелого сперматогенеза, - занимает почти 3 мес, любое негативное воздействие (лихорадка, стресс, отравление и др.) может оказывать влияние на качество спермы в течение этого времени.

Необходимо понимать, что даже при большом количестве сперматозоидов, хорошей подвижности, они могут не выполнить свою главную функцию – оплодотворение яйцеклетки, потому что, есть «поломка» на другом уровне. По последним данным, до 30% случаев мужское бесплодие имеет место при «нормозооспермии» - формально нормальной спермограмме. Установление мужского фактора бесплодия требует в этом случае использование специальных функциональных тестов.

Базовыми исследованиями для постановки диагноза «фертилен» или «бесплоден» (может иметь детей или нет), в настоящее время являются:

Спермограмма – определение объема, вязкости, рН спермы, концентрации, подвижности и морфологии сперматозоидов, их агглютинации, количества лейкоцитов и ряда других параметров.

МАR–тест - тест на наличие антиспермальных антител (АСАТ), приводящих к иммунному бесплодию. Различают АСАТ класса IgG и класса IgA, имеющие свои особенности.

Активные формы кислорода (АФК или ROS) в нативном эякуляте (сперме) и на отмытых сперматозоидов. Увеличение продукции активных форм кислорода в нативном эякуляте является чувствительным маркером инфекционно-воспалительного процесса (более чувствительным, чем количество лейкоцитов). Продукция АФК отмытыми сперматозоидами – признак оксидативного стресса половых клеток, при котором страдают даже хромосомы. Оксидативный стресс сперматозоидов – причина не только мужского бесплодия, но невынашивания беременности и врожденных аномалий у детей.

Эти три анализа помогут в постановке правильного диагноза, наметят пути дальнейшего лечения, либо определят необходимость дополнительного исследования при обнаруженных нарушениях.

Необходимо отметить, что каждый день приходят молодые мужчины на сдачу спермограммы и даже не подозревают о наличии гнойного процесса, когда в семенной плазме имеется большое количество лейкоцитов. Это может привести к дальнейшей закупорке семявыносящих путей и в итоге сперматозоиды не выходят наружу или еще хуже, нарушается их процесс формирования. В результате, диагностика фертильности мужчины и инфекционного процесса у нас в лаборатории неразделимы. Только в окрашенных мазках можно увидеть и отличить лейкоциты и незрелые клетки сперматогенеза на разных стадиях развития. И если обнаружен гнойный процесс, то сразу сперму можно исследовать на инфекции передаваемые половым путем и сделать бактериальный посев на аэробы и анаэробы. Так же надо понимать, что воспаление можно обнаружить в сперме, а секрет простаты будет в норме, и наоборот, в секрете простаты может быть воспаление, а в сперме норма. Инфекции передаваемые половым путем исследуют из соскоба, взятого из уретры, для этого пациент должен не мочиться более трех часов. К нам на анализы обращаются мужчины разного возраста для адекватной постановки диагноза «простатит».

Учитывая образ жизни современного молодого мужчины - раннюю половую жизнь, большое количество половых партнерш, секс без барьерной контрацепции, малоподвижный образ жизни, стрессы, - мы рекомендуем профилактически обследоваться не только на инфекции, но и сдавать спермограмму, для контроля рождения здорового потомства.

Нами исследована продукция АФК нейтрофилами (Нф) и моноцитами(Мн) с помощью тестов люминолзависимой и люцигенинзависимой (спонтанной и индуцированной убитым стафилококком) хемилюминесценции (ХЛ), отражающих соответственно продукцию высокотоксичных активных форм кислорода (АФК) в системе миелопероксидазы и супероксиданиона у 66 больных СКВ, а также у 22 здоровых доноров. Средний возраст больных СКВ составлял 41,4±10,9 года, длительность процесса соответственно 11±4 года. Минимальная степень активности воспалительного процесса (А1) диагностирована у 41 больного (62,1%), умеренная (АII) - у 25 (37,9%). Острое течение заболевания встречалось у единичных больных (данные их обследования не включены в настоящую работу), подострое течение - у 38 (57,6%), хроническое - у 28 (42,4%). Суставной синдром при СКВ встречался у 49 больных (74,2%).

У больных СКВ, как при наличии, так и при отсутствии поражения суставов, продукция АФК, как Нф, так и Мн, по данным тестов спонтанной люцигенин- и люминолзависимой ХЛ была увеличена по сравнению с показателями группы контроля, характеризуясь выработкой широкого спектра АФК, в том числе высокотоксичных, с мощным гистодеструктивным действием. Индуцированные тесты ХЛ характеризовались вариабельностью, а коэффициенты активации фагоцитов при обеих формах красной волчанки, как правило, были уменьшены, указывая на снижение резервных функций циркулирующих фагоцитов.

При сравнении исследуемых показателей у больных СКВ в зависимости от наличия или отсутствия у них суставного синдрома констатировано снижение индуцированной люцигенинзависимой ХЛ Нф и спонтанной люминолзависимой ХЛ Нф у пациентов с поражениями суставов по сравнению с аналогичными данными в группе больных СКВ с отсутствием суставных поражений.

Проведенные исследования свидетельствуют о повышенной продукции АФК циркулирующими фагоцитами при СКВ, независимо от того, имеются или отсутствуют поражения суставов. Вместе с тем, развитие поражений суставов у больных СКВ сопровождается снижением некоторых показателей окислительного стресса нейтрофилов, что демонстрирует многоликость проявлений окислительного стресса фагоцитов в зависимости от клинических проявлений, в частности, от развития суставных поражений.

Работа представлена на II научную конференцию студентов, молодых ученых и специалистов с международным участием «Современные проблемы науки и образования», 19-26 февраля 2005г. Хургада (Египет)

Библиографическая ссылка

ПРИЧИНЫ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА СПЕРМАТОЗОИДОВ (АФК\ROS тест)

Активные формы кислорода (АФК), или reactive oxygen species (ROS), являются метаболитами кислорода и включают супероксид-анион, перекись водорода, гидроксильные и гидропероксильные радикалы и оксид азота.

Когда АФК присутствуют в сперме в избытке, они могут инициировать патологические изменения сперматозоидов, вызывая окислительное повреждение клеточных липидов, белков и ДНК. Такие нарушения получили названия оксидативный стресс (ОС) сперматозоидов.

За счет снижения подвижности, нарушения акросомной реакции, повреждения рецепторов сперматозоидов ОС приводит к снижению вероятности наступления беременности. Вызывая разрывы (фрагментацию) ДНК сперматозоидов ОС приводит к нарушению развития зародыша, что сопровождается замершими беременностями, выкидышами на ранних сроках, аномалиями развития и возникновением злокачественных новообразований у детей.

Человеческий сперматозоид очень восприимчив к оксидативному стрессу.

ОС сперматозоидов оказывает отрицательное влияние, как на прогноз естественного зачатия, так и на результаты вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в т.ч. ИКСИ.

Согласно Рекомендациям Всемирной Организации Здравоохранения (WHO-2010), Европейской ассоциации репродукции человека и эмбриологии (ESHRE-2016) и Европейской урологической ассоциации (EAU-2017) определение АФК входит в перечень рекомендуемых методов обследования при мужском бесплодии и нарушениях развития беременности.

F​ Оксидативный стресс сперматозоидов имеет место в 30-80% (по нашим данным около 40%) случаев при бездетном браке.

Факторы риска ОС сперматозоидов многочисленны:

​ инфекционно-воспалительные процессы в органах мочеполового тракта;

​ варикоцеле;

​ крипторхизм;

​ перегревание при лихорадочных состояниях, или действии внешних источников тепла (сауна, горячая ванна и др.);

​ психо-эмоциональные стрессы;

​ аутоиммунные реакции против сперматозоидов, сопровождающиеся выработкой антиспермальных антител (АСАТ);

​ системные заболевания (диабет, подагра и др.);

​ курение;

​ возраст старше 40 лет;

​ нехватка антиоксидантов в пище;

​ генетические дефекты системы антиоксидантной защиты.

Для оценки ОС сперматозоидов в научных исследованиях могут применяться различные тесты: прямые методы определения АФК (хемилюминесценция, NBT-тест), или непрямые методы оценки повреждений, возникших в результате ОС (определение изопростана, малонового альдегида и др.).

Единственный метод оценки оксидативного стресса, рекомендованный ВОЗ-2010 для клинических целей – метод люминолзависимой хемилюминесценции, который используем мы.

В этой процедуре применяется чувствительный люминометр для измерения малых количеств света, генерируемого сперматозоидами человека, в присутствии хемилюминесцентного зонда, такого как люминол. Описанная в Руководстве ВОЗ-2010 и используемая нами методика основана на применении смеси люминола и пероксидазы хрена для проведения чувствительных измерений образования перекиси водорода.

Примеры записи люминолзависимой хемилюминесценции эякулятов различных пациентов

(кривые I-IV).

В эякуляте человека АФК продуцируются сперматозоидами, незрелыми клетками сперматогенеза и лейкоцитами. Один лейкоцит может генерировать по меньшей мере в 100 раз больше АФК, чем сперматозоид.

Различные модификации метода применяются для оценки функциональной активности лейкоцитов и непосредственно ОС сперматозоидов.

В нашей лаборатории в настоящее время применяют три метода оценки ОС на основе хемилюминесценции:

-​ определение АФК в нативном эякуляте, что отражает суммарную продукцию АФК, зависящую в значительной степени от концентрации лейкоцитов и активности воспалительного процесса;

-​ оценка продукции АФК отмытыми сперматозоидами (на 10 млн. клеток), что отражает выраженность внутриклеточного ОС;

-​ определение антиокислительной емкости семенной плазмы, что служит основанием для назначения антиоксидантов.

Семенная плазма обладает свойствами связывать избыточную продукцию АФК, но активность антиоксидантных ферментов может быть у некоторых мужчин недостаточной. Для характеристики антиоксидантной емкости спермы используется специальная методика с использованием сульфата железа.

Запись хемилюминесценции модельной системы, генерирующей АФК (кривая М), и модельной системы, генерирующей АФК, с добавлением 0,1мл спермоплазмы пациентов I, II, III, IV (кривые I-IV).

Доктор мед. наук, профессор В.А.Божедомов

Несколько цитат о роли активных форм кислорода (АФК/ROS):

-​ «…Высокое производство ROS может вызывать перекисное повреждение и потерю функции спермы, а также повреждение ДНК, как в ядерном, так и в митохондриальном геномах…»

по WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen / Editor-in-chief Dr. Trevor G. Cooper - 5th ed. 2010: 132.

-​ «… Оксидативный стресс является одной из ведущих причин повреждения спермальных ДНК…»

По C.Celik-Ozenci, G.Huszar // Male infertility. S.J.Perekatti, A.Agarwal (Eds.). Springer New York Heidelberg Dordrecht London, 2012: 462.

-​ «…Считается, что от 30% до 80% случаев мужского бесплодия связаны с повреждающим действием окислительного стресса на сперму, и 1 человек из 20 будет страдать из-за этого от субфертильности…»

Showell M.G. et al. Antioxidants for male subfertility (Review). Copyright © 2014 The Cochrane Collaboration. Published by JohnWiley & Sons, Ltd.

-​ «…Повышение уровня ROS, связанное с лейкоцитоспермией, может вести к повреждению клеточных мембран, внеклеточных протеинов, органелл и спермальных ДНК…»

По Smelov V.// Prostatitis and its management. T.Cai, T.E.B.Johansen (Eds.).-Springer Cham Heidelberg New York Dordrecht London, 2016: 123.